1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

(1)灌膠前的準(zhǔn)備：a) 洗板；b)配板

(2)凝膠的配制

(3)灌膠

(4)樣品制備、上樣

(5)電泳

2、轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素薄膜上

(1)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移緩沖液。

(2)切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素薄膜，并用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕，放置15 min直到?jīng)]有氣泡。

(3)切割8張普通濾紙，其大小與膠尺寸大小相符，并將其浸泡在有轉(zhuǎn)移緩沖液的培養(yǎng)皿中(與硝酸纖維素薄膜分開浸泡)。

(4)電泳后，切取有用部分的膠，并很快地在轉(zhuǎn)移緩沖液中洗滌。

(5)打開蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的蓋板，依次放入：

①4張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙；

②用轉(zhuǎn)移緩沖液洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的所有氣泡；

③放上硝酸纖維素膜；

④另4張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙。

(6)小心地合上轉(zhuǎn)移槽的蓋板；

(7)插入電極，注意正負(fù)極方向(硝酸纖維素膜面向陽極)，轉(zhuǎn)膜裝置置于冰水中，打開電泳儀開關(guān)，調(diào)至膠的面積(cm2)×0.8 mA，1~2 h。

(8)轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開蓋板取出硝酸纖維素薄膜。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

3、免疫印跡膜的處理

(1)用TBST緩沖液洗膜3次，每次10-15 min。

(2)將膜用封閉溶液封閉，用搖床輕搖4℃過夜或室溫封閉1h。

(3)用TBST緩沖液洗膜3次，每次10-15 min。

(4)將膜置于第一抗體溶液中，置搖床上輕搖，37℃搖動1-2 h，或4℃緩慢搖動孵育過夜。

(5)回收一抗，并用TBST洗膜3次，每次10-15 min。

(6)將膜置于辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG溶液中，37℃輕搖1 h。

(7)回收二抗，并用TBST洗膜3次，每次10 min。

(8)最后用TBS溶液洗，以轉(zhuǎn)移Tween-20。

(9)加底物溶液反應(yīng)2～10min，至抗原區(qū)帶顯色清楚為止。

(10)用去離子水洗滌，以終止反應(yīng)。將膜夾在濾紙間，干燥。置暗處保存。